Karbamazepina w wodzie: hybrydowy system usuwa 90% leku w 15 minut

Czy karbamazepina w wodzie to problem globalny?

Karbamazepina (CBZ) – jeden z najczęściej stosowanych leków przeciwpadaczkowych – stała się jednym z najbardziej rozpowszechnionych zanieczyszczeń farmaceutycznych w środowisku wodnym na wszystkich kontynentach. Wykrywana jest w stężeniach od 442 mg/L w ściekach przemysłowych w Indiach, przez 288 μg/L w ściekach miejskich we Francji, aż po 96 ng/L w wodach gruntowych w USA. Co niepokojące, konwencjonalne oczyszczalnie ścieków wykazują alarmująco niską skuteczność usuwania CBZ – w wielu przypadkach notuje się nawet ujemne bilanse masowe, co oznacza, że stężenie leku na wyjściu z oczyszczalni jest wyższe niż na wejściu.

Problem dotyczy także Polski – badania prowadzone w pięciu miejskich oczyszczalniach ścieków w Brazylii wykazały 100% częstość wykrywalności CBZ w próbkach przed i po każdym etapie oczyszczania, niezależnie od konfiguracji technologicznej. To globalne zjawisko niezależne od stosowanej metody oczyszczania wymaga pilnego wdrożenia zaawansowanych technologii degradacji.

Jak połączenie enzymu z fotokatalitycznym utlenianiem zmienia zasady gry?

Naukowcy z Kanady opracowali nowatorski system hybrydowy, który łączy reakcje enzymatyczne laccazy z procesem photo-Fenton w jednym reaktorze. Kluczowym elementem jest immobilizacja laccazy na powierzchni magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (Fe₃O₄), co znacząco zwiększa stabilność enzymu i umożliwia jego wielokrotne wykorzystanie. Materiał Lac-MNPs uzyskał aktywność 1,87 ± 0,08 U na mg nośnika, przy czym przez 50 dni przechowywania w buforze fosforanowo-cytrynianowym w temperaturze 4°C zachowywał około 49% początkowej aktywności.

Immobilizacja enzymu przyniosła przełomowe rezultaty w zakresie odporności na warunki reakcji. Po 60 minutach ekspozycji na promieniowanie UVC immobilizowana laccaza zachowała 77,7 ± 5,5% aktywności, podczas gdy wolny enzym całkowicie utracił swoją funkcję już po 30 minutach. Co więcej, immobilizowana forma wykazała większą stabilność termiczną – w temperaturze 25°C (w której prowadzono reakcje degradacji) jej aktywność względna wynosiła 84 ± 4%, w porównaniu z 49 ± 7% dla wolnej laccazy.

Jakie warunki zapewniają najwyższą skuteczność usuwania karbamazepiny?

System hybrydowy został zoptymalizowany przy użyciu centralnego kompozytowego projektu eksperymentalnego (CCRD) z dwoma zmiennymi: stosunkiem molowym H₂O₂:CBZ oraz stężeniem ABTS (mediatora laccazy). Badania przeprowadzono w trybie wsadowym oraz w przepływie ciągłym, wykorzystując reaktor płasko-płytowy wydrukowany w technologii 3D o objętości reakcyjnej 5,1 cm³ i napromieniowanej powierzchni 16,7 cm².

W trybie wsadowym, przy początkowym stężeniu [CBZ]₀ = 5 mg/L, system Lac-MNPs/ABTS/UVC/H₂O₂ osiągnął 91,9 ± 2,1% usunięcia CBZ po 15 minutach reakcji. Optymalne warunki obejmowały: stosunek molowy H₂O₂:CBZ wynoszący 20:1 (odpowiadający 14,4 mg/L H₂O₂), stężenie ABTS 30 μmol/L, stężenie Lac-MNPs 0,8 g/L oraz natężenie promieniowania UVC 42,5 W/m². Stała szybkości pseudo-pierwszego rzędu wynosiła k = 0,146 ± 0,008 min⁻¹ (R² = 0,994).

W trybie przepływu ciągłego, przy czasie przebywania 10 minut, system osiągnął 91,1% usunięcia CBZ przy tych samych warunkach optymalnych. Co istotne, stan stacjonarny został osiągnięty już po 15 minutach pracy reaktora i utrzymywał się stabilnie przez kolejne 60 minut – to obiecujący wynik w porównaniu z systemami mikrobiologicznymi, które wymagają kilku tygodni do osiągnięcia stanu ustalonego.

Matematyczny model empiryczny opisujący skuteczność usuwania CBZ został zwalidowany przez analizę wariancji (R² = 0,8707, p = 0,028) i wskazuje, że 90% usunięcie można osiągnąć przy stosunku molowym 17:1 i stężeniu ABTS w zakresie 17-23 μmol/L, co zapewnia elastyczność operacyjną systemu.

Jak przebiega degradacja karbamazepiny w systemie hybrydowym?

Degradacja CBZ w systemie hybrydowym opiera się na synergicznym działaniu kilku mechanizmów reakcyjnych. Laccaza utlenia ABTS do rodnika kationowego ABTS•⁺, który następnie działa jako mediator redoks, utleniając CBZ i generując rodniki kationowe karbamazepiny oraz produkty pośrednie. Równocześnie proces photo-Fenton generuje reaktywne formy tlenu – głównie rodniki hydroksylowe (•OH) – poprzez reakcje między Fe²⁺/Fe³⁺ z nanocząstek magnetytu, H₂O₂ i promieniowaniem UVC.

Analiza produktów transformacji (TPs) metodą LC-MS/MS w trybie jonizacji dodatniej pozwoliła zidentyfikować 15 związków pośrednich. Główne mechanizmy degradacji obejmują: utlenianie, epoksydację, hydroksylację, rozpad pierścienia, abstrakcję wodoru i dekarboksylację. Kluczowe produkty to:

• TP1 (m/z 267), TP2 (m/z 271) oraz TP3 i TP4 (m/z 253) – powstające przez utlenianie mediowane UV lub rodnikami hydroksylowymi wiązania podwójnego w centralnym siedmioczłonowym pierścieniu CBZ
• TP7 (m/z 287) – produkt ataku •OH na CBZ-10,11-diol, będący prekursorem TP14 i TP15
• TP9 (akrydyna, m/z 180) – powstająca przez rozszczepienie grupy aminowej, abstrakcję wodoru i dekarboksylację
• TP14 i TP15 (kwas akrydyno-9-karboksylowy, m/z 224) – produkty dalszej degradacji z rozerwaniem pierścienia

Zmiana pH roztworu po oczyszczaniu (z >7 do około 4) potwierdza powstawanie kwasów organicznych o niskiej masie cząsteczkowej jako końcowych produktów degradacji, co jest zgodne z proponowanym szlakiem prowadzącym do mineralizacji CBZ.

Czy produkty degradacji są bezpieczne dla środowiska?

Ocena ekotoksyczności produktów transformacji CBZ przeprowadzona metodą in silico (oprogramowanie ECOSAR) ujawniła niepokojące wyniki. Spośród 15 zidentyfikowanych TPs tylko TP13 wykazał niższe ryzyko zarówno dla toksyczności ostrej (PNEC = 0,113 mg/L), jak i przewlekłej (COC = 1,509 mg/L) w porównaniu z macierzystą karbamazepiną (PNEC = 0,055 mg/L; COC = 0,701 mg/L).

Szczególnie niepokojące są następujące związki:

• Karbamazepina-10,11-epoksyd (TP3 i TP4, m/z 253) – znany metabolit CBZ wykazujący zwiększone wskaźniki malformacji embrionalnych u ryb zebra w porównaniu z lekiem macierzystym
• Akrydyna (TP9, m/z 180) – wykazuje wyższą toksyczność ostrą dla trzech organizmów modelowych (Vibrio fischeri, Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna) zgodnie z protokołami ISO
• TP6 i TP9 – najwyższe ryzyko toksyczności ostrej (wartości PNEC do 10 razy niższe niż dla CBZ)
• TP3, TP6, TP8 i TP4 – najwyższe ryzyko toksyczności przewlekłej

Badania in vivo potwierdzają przewidywania modeli QSAR. Kwas akrydyno-9-karboksylowy (TP14 i TP15) u rośliny Lemna minor znacząco zwiększał wskaźnik bilansu azotu, podczas gdy u zwierzęcia Hydra circumcincta oba związki – CBZ i jego metabolit – powodowały stres oksydacyjny bez zmiany zachowań żywieniowych.

Należy podkreślić, że wolne rodniki odpowiedzialne za hydroksylację i rozpad pierścieni kontynuują działanie na TPs, prowadząc do powstania małych kwasów organicznych i ostatecznie do mineralizacji CBZ. Efekty toksyczne zależą od wielu czynników, w tym dróg i wzorców ekspozycji, stężenia w wodzie oraz parametrów środowiskowych, co uniemożliwia jednoznaczne stwierdzenie, czy roztwór po oczyszczaniu jest bardziej czy mniej toksyczny niż roztwór zawierający wyłącznie CBZ.

Jakie są praktyczne zalety systemu hybrydowego?

Proponowany system łączący reakcje enzymatyczne i fotokatalityczne w jednym reaktorze oferuje szereg korzyści operacyjnych w porównaniu z konwencjonalnymi metodami:

• Redukcja zużycia chemikaliów – dwukrotnie niższa dawka H₂O₂ w porównaniu z procesem UVC/H₂O₂ przy porównywalnej skuteczności usuwania
• Praca w neutralnym pH – typowe dla photo-Fenton pH około 3 nie jest wymagane, co eliminuje potrzebę dodatkowej regulacji pH
• Łatwe odzyskiwanie biokatalizatora – Lac-MNPs są przyciągane magnesem, co umożliwia ciągłe wykorzystanie w reaktorze przepływowym
• Krótki czas reakcji – 10-15 minut w porównaniu z godzinami lub dniami dla systemów czysto enzymatycznych
• Szybkie osiągnięcie stanu stacjonarnego – 15 minut vs kilka tygodni dla systemów mikrobiologicznych
• Jednolite naświetlanie – geometria reaktora płasko-płytowego zapewnia optymalne wykorzystanie światła UVC
• Możliwość automatyzacji – ciągły przepływ umożliwia łatwą kontrolę dozowania reagentów

Warto zauważyć, że system wykazuje podobną skuteczność zarówno w trybie wsadowym, jak i przepływu ciągłego (91,9 ± 2,1% vs 91,1%), co świadczy o jego wszechstronności i niezawodności. Jednak tryb ciągły lepiej odpowiada na przemysłowe i społeczne potrzeby, ponieważ ścieki są generowane w sposób ciągły.

Jakie wyzwania stoją przed wdrożeniem tej technologii?

Pomimo obiecujących wyników laboratoryjnych technologia wymaga dalszych badań przed pełnoskalowym wdrożeniem:

• Stabilność enzymu przy wielokrotnym użyciu – aktywność Lac-MNPs spadała do 25,6 ± 3,5% w pierwszym cyklu i do zera po 6-10 cyklach przy utlenianiu ABTS, co sugeruje saturację miejsc katalitycznych lub denaturację białka
• Toksyczność produktów transformacji – brak badań in vivo na oczyszczonej wodzie; niektóre TPs wykazują potencjalnie wyższą toksyczność niż CBZ
• Skalowalność procesu – przejście z reaktora o objętości 5,1 cm³ do instalacji przemysłowej wymaga optymalizacji parametrów hydraulicznych i świetlnych
• Koszty infrastruktury – według Holtze i Boehlinga przetwarzanie w przepływie oferuje korzyści ekonomiczne i środowiskowe, ale napotyka wysokie bariery rozwojowe z powodu niewystarczającej infrastruktury, sprzętu, wiedzy eksperckiej i najlepszych praktyk
• Czas przechowywania biokatalizatora – po 77 dniach aktywność spadała do 0,34 U/mg (82% redukcji), co może ograniczać długoterminową operacyjność systemu

Należy również rozważyć szerszy kontekst – obecność karbamazepiny-10,11-epoksydu w wodach środowiskowych wynika nie tylko z degradacji CBZ przez procesy oczyszczania, ale także z metabolizacji leku w wątrobie ludzkiej, gdzie jest to główny metabolit. To podkreśla złożoność problemu zanieczyszczenia farmaceutycznego i potrzebę kompleksowego podejścia, obejmującego zarówno źródła emisji, jak i technologie oczyszczania.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej i ochrony środowiska?

Hybrydowy system laccaza–photo-Fenton stanowi przełomowe podejście do usuwania karbamazepiny z wody, łącząc szybkość reakcji fotokatalitycznych z selektywnością enzymatyczną. Osiągnięcie ponad 90% usunięcia w czasie 10-15 minut przy neutralnym pH i obniżonej dawce H₂O₂ to znaczący postęp w porównaniu z konwencjonalnymi metodami, które często wykazują ujemną skuteczność usuwania CBZ. Dla lekarzy i farmaceutów kluczowe jest zrozumienie, że leki przeciwpadaczkowe – mimo swojej terapeutycznej wartości – stają się znaczącym zanieczyszczeniem środowiskowym o globalnym zasięgu. Obecność CBZ w wodzie pitnej, nawet w niskich stężeniach, może wpływać na zdrowie populacji poprzez przewlekłą ekspozycję. Technologia wymaga dalszych badań, szczególnie w zakresie długoterminowej oceny toksykologicznej produktów degradacji oraz optymalizacji dla warunków przemysłowych.