Carbamazepina w wodzie pitnej może opóźniać rozwój płodu – nowe badania

Czy środowiskowe poziomy carbamazepiny stanowią zagrożenie?

Carbamazepina w wodzie pitnej może opóźniać rozwój embrionalny – alarmujące wyniki badań na modelach zwierzęcych

Okres perinatalny to czas szczególnej wrażliwości na czynniki środowiskowe, zwłaszcza we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego, gdy kształtują się kluczowe układy organizmu. Ekspozycja na zanieczyszczenia środowiskowe w tym krytycznym okresie może prowadzić do szeregu defektów, w tym wad wrodzonych, zaburzeń neurologicznych, wewnątrzmacicznego opóźnienia wzrostu, a nawet poronienia. Nowe badanie opublikowane w ACS Omega zwraca uwagę na potencjalne zagrożenie związane z obecnością carbamazepiny w środowisku wodnym i jej wpływem na rozwój embrionalny.

Carbamazepina (Tegretol), powszechnie stosowany lek przeciwpadaczkowy, jest jednym z najbardziej trwałych farmaceutyków znajdowanych w ściekach i oczyszczonej wodzie. Co więcej, po nawadnianiu oczyszczonymi ściekami, carbamazepina gromadzi się w glebach i uprawach, wchodzi do łańcucha pokarmowego i dociera do populacji poprzez spożywanie żywności. Osoby mieszkające w regionach, gdzie powszechnie wykorzystuje się oczyszczone ścieki, są nieświadomie narażone na carbamazepinę ze środowiska. Choć stężenia środowiskowe carbamazepiny w oczyszczonych ściekach są znacznie niższe niż poziomy kliniczne w osoczu pacjentów (ng/L vs mg/L), potencjalny wpływ mimowolnej, przewlekłej ekspozycji populacji ogólnej na środowiskowe stężenia tego leku wymaga dokładniejszego zbadania.

Jak wpływa carbamazepina na rozwój zarodkowy w modelu myszy?

Zespół badawczy z Izraela postanowił sprawdzić, czy ekspozycja na środowiskowo istotne stężenia carbamazepiny może potencjalnie zakłócać rozwój zarodków ssaków. Wykorzystali zarodki myszy jako powszechny przedkliniczny model organizmu, ściśle naśladujący kluczowe aspekty embriogenezy ludzkiej. Aby dokładnie odtworzyć długoterminową i nieinwazyjną drogę ekspozycji ludzkich zarodków na zanieczyszczenia środowiskowe poprzez transfer matczyny, samicom myszy podawano standardową wodę pitną lub wodę pitną uzupełnioną o 200 ng/L, 500 ng/L lub 2000 ng/L carbamazepiny – stężenia często spotykane w środowisku.

Samice myszy były eksponowane przez różne okresy (3-20 tygodni) w celu oceny, czy czas ekspozycji może wywierać specyficzny wpływ na rozwój embrionalny. Po zapłodnieniu, macice były pobierane w 9,5 dniu ciąży. Wszystkie grupy eksperymentalne wykazywały średnio 8-9 kieszonek ciążowych, bez statystycznie istotnych różnic między grupami. Większość kieszonek ciążowych zawierała żywotne zarodki, podczas gdy około 1-2 kieszonki czasami zawierały zresorbowane zarodki. Wyniki te pokazują, że ekspozycja samic na szereg środowiskowo istotnych stężeń carbamazepiny nie zaburza ich zdolności do utrzymania ciąży, umożliwienia implantacji zarodka ani nie zmienia ogólnej wielkości miotu.

Następnie naukowcy zbadali morfologię pobranych zarodków. Większość zarodków w każdym miocie wykazywała oczekiwane stadium embrionalne (E) 9,5, bez widocznych wad rozwojowych. Jednak podczas gdy wszystkie zarodki z tego samego miotu były obrazowane w identycznych warunkach powiększenia, zaobserwowano względne różnice w wielkości między zarodkami, przy czym niektóre wydawały się nieco lub znacznie mniejsze niż ich rodzeństwo. “Nasze wyniki jednoznacznie wskazują na zależny od dawki spadek stadium embrionalnego przy ekspozycji matczynej na carbamazepinę” – piszą autorzy badania.

Aby dokładniej zmierzyć wzrost embrionalny w bardziej wymierny sposób, liczono somity (pary segmentów, z których rozwijają się kręgi i mięśnie osiowe). Somity tworzą się sekwencyjnie w regularnych 2-godzinnych odstępach i odzwierciedlają precyzyjne stadium morfologiczne zarodka. Zliczanie somitów wykazało średnio 22,77 i 22,08 somitów odpowiednio w grupach kontrolnej i 200 ng/L. Jednak grupy 500 ng/L i 2000 ng/L wykazywały mniej somitów, średnio odpowiednio 21,33 i 19,31, co wskazuje na znaczący, zależny od dawki spadek liczby somitów przy ekspozycji na carbamazepinę.

Co ciekawe, badanie wykazało również opóźnienie w rozwoju serca. Serce, które jest pierwszym funkcjonalnym narządem w zarodku, przechodzi ściśle uporządkowaną sekwencję zdarzeń morfogenetycznych od E8 do E10. Średnie wyniki oceny rozwoju serca dla zarodków z grup kontrolnej i 200 ng/L carbamazepiny wynosiły odpowiednio 3,329 i 3,421, podczas gdy grupy 500 ng/L i 2000 ng/L wykazywały niższe wyniki, średnio 3,111 i 3,032. Wyniki te wskazywały na znaczące, zależne od dawki opóźnienie w rozwoju serca.

Jakie molekularne mechanizmy opóźnienia wzrostu można zaobserwować?

Czy możliwe jest, że obserwowane opóźnienie wzrostu było skoordynowane we wszystkich parametrach, czy też występowały dysproporcje w rozwoju różnych układów narządów? Aby to ustalić, badacze zintegrowali dane z liczby somitów, stadium embrionalnego i wyników oceny serca w wielowymiarowy wykres. Analiza wykazała spójną korelację we wszystkich grupach eksperymentalnych: liczba somitów bezpośrednio odpowiadała zarówno wynikowi rozwojowemu serca, jak i stadium embrionalnemu, demonstrując zsynchronizowany postęp tych parametrów rozwojowych, który był proporcjonalnie opóźniony wraz ze wzrostem stężenia carbamazepiny.

Naukowcy przeprowadzili również szczegółową analizę mikroskopową za pomocą HREM (High-Resolution Electron Microscopy) na reprezentatywnych zarodkach z grup kontrolnej i 2000 ng/L carbamazepiny. Analiza HREM wykazała wyraźne opóźnienie rozwojowe w zarodku eksponowanym na carbamazepinę w porównaniu do kontroli. Na przykład, podczas gdy zarodek kontrolny osiągnął 22 somity, zarodek eksponowany na carbamazepinę rozwinął się tylko do 18. Mimo tej różnicy, somity nie wykazywały nieprawidłowości w strukturze, wielkości ani symetrycznym rozkładzie wzdłuż osi ciała.

Badanie morfologii zawiązków kończyn i łuków gardłowych również wykazało różnice – zarodek kontrolny miał większe i bardziej zaawansowane struktury w porównaniu do zarodka eksponowanego na carbamazepinę. Jednak ogólny kształt i pozycja tych tkanek wydawały się normalne w zarodku z opóźnionym wzrostem. Przekroje czołowe przez region tułowia (somity 7-11) ujawniły dalsze różnice. W zarodku kontrolnym sklerotomy (komórki prekursorowe chrząstki i kości) były bardziej skondensowane, a pierwotne miotomy (prekursory mięśni osiowych) były wyraźnie uformowane. Natomiast zarodek eksponowany na carbamazepinę wykazywał mniej skondensowane sklerotomy i minimalną formację miotomów, wskazując na opóźnione różnicowanie somitów.

Widoki tylne regionu ogonowego również ujawniły różnice w rozwoju cewy nerwowej. Neuropor ogonowy w zarodku kontrolnym był prawie zamknięty, podczas gdy pozostawał szeroko otwarty z rozszerzoną bruzdą nerwową w zarodku eksponowanym na carbamazepinę – cechy charakterystyczne dla mniej rozwiniętych cew nerwowych. Wreszcie, badanie przekrojów czołowych serca ujawniło wyraźne różnice w rozwoju sercowym. W kontroli warstwy miokardium i endokardium były dobrze zdefiniowane, a beleczki mięśniowe były widoczne zarówno w przedsionkach, jak i komorach. Natomiast zarodek eksponowany na carbamazepinę wykazywał cieńszą warstwę miokardium, gładsze wewnętrzne powierzchnie komorowe i przedsionkowe oraz brak beleczek mięśniowych. Niemniej jednak, podział serca i początkowa formacja drogi odpływu wydawały się normalne.

Jak wyniki eksperymentalne odnoszą się do różnic międzygatunkowych i obserwacji klinicznych?

Analizy HREM wzmacniają ustalenia, że ekspozycja samic myszy na 2000 ng/L carbamazepiny wywołuje zauważalne opóźnienie wzrostu w zarodkach bez powodowania wad rozwojowych w 9,5 dniu ciąży. Sugeruje to, że oprócz opóźnienia wzrostu embrionalnego (EGR), carbamazepina w tych stężeniach nie indukuje poważnych defektów w zarodkach ssaków, w przeciwieństwie do jej teratogennego efektu przy dawkach klinicznych. Jednak możliwości późniejszego wystąpienia wad wrodzonych nie można wykluczyć.

Jednym z potencjalnych mechanizmów, przez który carbamazepina indukuje opóźnienie wzrostu embrionalnego, jest jej wpływ na geny cyklu komórkowego. Aby to zbadać, mRNA było ekstrahowane z zarodków wszystkich grup eksperymentalnych w celu oceny ekspresji wybranych genów. Badacze zaobserwowali znaczącą redukcję poziomów ekspresji cykliny D1 i kinazy zależnej od cykliny 2 (CDK2) w zarodkach z grup 500 i 2000 ng/L carbamazepiny w porównaniu do grup kontrolnej i 200 ng/L. Te ustalenia są zgodne z badaniami knock-out na myszach pokazującymi, że zarodki/noworodki z niedoborem cykliny D1 lub CDK2 są mniejsze niż ich dzikie rodzeństwo.

Badacze zbadali również ekspresję dwóch dodatkowych regulatorów cyklu komórkowego, genów podatności na raka piersi BRCA1/2, które regulują naprawę DNA podczas podziału komórkowego. W przeciwieństwie do cykliny D1/CDK2, ich ekspresja nie różniła się znacząco między grupami. Ten wynik sugeruje, że wpływ carbamazepiny na cykl komórkowy nie jest głównie indukowany przez uszkodzenie DNA, ponieważ zwykle skutkowałoby to zwiększoną regulacją tych genów. Co istotne, fakt, że carbamazepina nie zmieniła ekspresji wszystkich badanych genów, przemawia przeciwko niespecyficznemu/toksycznemu wpływowi na globalną transkrypcję genów.

Ekspresja genów Oct4, Sox2, Sox9 i Hand1 była również obniżona w grupach 500 i 2000 ng/L carbamazepiny w porównaniu do grupy kontrolnej i 200 ng/L. Wyniki te sugerują, że opóźnienie wzrostu embrionalnego może być związane z obniżoną regulacją Sox2/9, prowadzącą do opóźnionego rozwoju linii komórkowych nerwowych i mezodermalnych, co potwierdzają niższa liczba somitów, mniej rozwinięte zawiązki kończyn i łuki gardłowe oraz opóźnione dojrzewanie somitów i cewy nerwowej.

Aby dalej zbadać wpływ carbamazepiny na podział komórkowy, zarodki z grup kontrolnej, 200 ng/L i 2000 ng/L carbamazepiny zostały zebrane w 9,5 dniu ciąży, rozdzielone na pojedyncze komórki i immunobarwione na obecność fosfo-histonu H3 (PhH3), specyficznego markera dla komórek w fazie M cyklu komórkowego. Cytometria przepływowa została użyta do ilościowego określenia odsetka komórek PhH3-pozytywnych w próbkach kontrolnych vs eksponowanych na carbamazepinę. Odsetek komórek wyrażających PhH3 był znacząco niższy w grupie 2000 ng/L carbamazepiny w porównaniu z grupą 200 ng/L. To ustalenie wskazuje, że opóźnienie rozwojowe indukowane przez ekspozycję matczyną na 2000 ng/L carbamazepiny jest związane ze zmniejszeniem liczby aktywnie dzielących się komórek, co jest zgodne z obserwowanym spadkiem ekspresji genów cyklu komórkowego.

Jakie są implikacje dla praktyki klinicznej i co powinien wiedzieć lekarz?

Ustalenia te są zgodne z wcześniejszymi badaniami na rybach danio pręgowanym, które wykazały opóźnione wylęganie zarodków po ekspozycji na niskie dawki carbamazepiny, efekt związany z zależnymi od dawki wpływami na reprodukcję, zachowanie, zachorowalność i śmiertelność. Podobnie, wcześniejsze prace na zarodkach kurzych wykazały negatywny, zależny od dawki wpływ środowiskowo istotnych poziomów carbamazepiny na ich wzrost. Jednak opóźnienie wzrostu w zarodkach kurzych było bardziej wyraźne niż u myszy i czasami towarzyszyły mu wady rozwojowe i śmiertelność.

Te gatunkowo specyficzne różnice mogą wynikać z kontrastujących dróg ekspozycji. W przeciwieństwie do zarodków myszy, które są eksponowane pośrednio, zarodki ryb danio i kurze doświadczają bezpośredniej ekspozycji na carbamazepinę poprzez otaczającą wodę lub jajo, potencjalnie skutkując wyższymi stężeniami leku kontaktującego się z ich rozwijającymi się układami ciała. Ponadto, biorąc pod uwagę, że wcześniejsze badania na rybach, myszach i hodowanych komórkach zgłaszały bardziej znaczące efekty przy wyższych środowiskowo istotnych dawkach carbamazepiny niż te użyte tutaj, możliwe jest, że bardziej poważne efekty zostaną wykryte w zarodkach myszy przy ekspozycji matczynej na wyższe stężenia carbamazepiny niż te użyte w tym badaniu.

Zróżnicowane efekty carbamazepiny na różne gatunki przy stężeniach istotnych środowiskowo mogą być również zależne od jej metabolizmu; metabolizm carbamazepiny u gryzoni jest znacznie szybszy niż u ryb danio pręgowanego (półokres rozpadu: około 1-4 godziny w porównaniu do około 12 godzin) oraz u ludzi (półokres rozpadu: około 12-24 godziny podczas przewlekłego stosowania). Gatunkowo specyficzny metabolizm carbamazepiny może tłumaczyć łagodniejsze defekty rozwojowe obserwowane u zarodków myszy w porównaniu z tymi zgłaszanymi u ryb danio, ponieważ szybki metabolizm ogranicza akumulację carbamazepiny i ułatwia jej detoksykację.

Podobnie, chociaż farmakokinetyka carbamazepiny nie została jeszcze bezpośrednio zbadana u gatunków ptaków, zgłaszano, że aktywność katalityczna i poziomy ekspresji enzymów CYP3A są niższe u ptaków niż u gryzoni. Te różnice mogą podobnie przyczyniać się do łagodniejszych wyników rozwojowych obserwowanych u zarodków myszy w porównaniu do zarodków kurzych, które były eksponowane na podobne stężenia carbamazepiny. Biorąc pod uwagę, że międzygatunkowe różnice w farmakokinetyce carbamazepiny są krytyczne dla oceny jej efektów teratogennych w różnych modelach organizmów, dalsze badania są niezbędne do określenia dokładnych stężeń carbamazepiny i jej metabolitów w różnych gatunkach zarodkowych, a także ich porównywalnej teratogenności.

Zgodnie z obserwacją łagodnego ograniczenia wzrostu u zarodków myszy eksponowanych na środowiskowo istotne stężenia carbamazepiny, znaczące zmniejszenie masy i długości płodu zgłaszano u gryzoni eksponowanych na klinicznie istotne dawki carbamazepiny. Tym efektom towarzyszyły inne wady rozwojowe i zaburzenia endokrynologiczne, wspierając zależne od dawki zakłócenie wzrostu zarodkowego myszy przez carbamazepinę.

Co istotne, liczne meta-analizy u ludzi potwierdziły, że ograniczenie wzrostu embrionalnego (EGR) jest potencjalnym wynikiem w ciążach kobiet leczonych carbamazepiną. Stwierdzono, że carbamazepina jest związana z umiarkowanym zmniejszeniem masy urodzeniowej i zwiększonym ryzykiem małej masy w stosunku do wieku ciążowego (SGA) w sposób zależny od dawki. Podobnie, duże prospektywne badanie NEAD (Neurodevelopmental Effects of Antiepileptic Drugs) wykazało, że ekspozycja na carbamazepinę in utero była związana ze zwiększonym wskaźnikiem SGA i mikrocefalii przy urodzeniu, choć wielkość głowy normalizowała się do 24 miesiąca życia. “Przejściowa mniejsza niż przeciętna wielkość głowy może odzwierciedlać nieprawidłowości neurorozwojowe, które mogą indukować wyższe wskaźniki zaburzeń behawioralnych i uczenia się oraz deficytów poznawczych u tych dzieci” – zauważają autorzy.

Jednakże nowsze badanie MONEAD (Maternal Outcomes and Neurodevelopmental Effects of Antiepileptic Drugs) nie znalazło takiej korelacji. Różnice między ustaleniami badań NEAD i MONEAD dotyczącymi wzrostu płodu prawdopodobnie wynikają ze zmian w praktyce klinicznej podawania carbamazepiny w czasie, które mogą zmniejszyć niekorzystne wyniki, różnic w projekcie badania, różnic populacyjnych oraz różnic w sposobie definiowania i mierzenia wyników wzrostu. Niemniej jednak te pozorne rozbieżności podkreślają znaczenie oceny ryzyka specyficznego dla leku przy zarządzaniu padaczką w ciąży, zrozumienia czynników zakłócających (tj. zdrowie matki, odżywianie, kontrola napadów, palenie), które mogą wpływać na wyniki płodowe, oraz wyjaśnienia, czy umiarkowany wzrost FGR (opóźnienie wzrostu płodu) jest również widoczny w regionach, gdzie carbamazepina jest powszechnie wykrywana w środowisku.

Dla lekarzy, zwłaszcza położników i ginekologów, te wyniki podkreślają znaczenie świadomości potencjalnego wpływu zanieczyszczeń środowiskowych na rozwój płodu. Chociaż stężenia carbamazepiny w środowisku są znacznie niższe niż dawki kliniczne, długotrwała ekspozycja może mieć subtelne, ale istotne efekty. Monitorowanie wzrostu płodu i rozwoju narządów podczas ciąży, zwłaszcza w regionach z znanym zanieczyszczeniem wody, może pomóc w identyfikacji i zarządzaniu potencjalnymi opóźnieniami rozwojowymi.

Dla klinicystów te wyniki podkreślają potrzebę bardziej holistycznego podejścia do oceny ryzyka teratogennego leków. Tradycyjnie uwaga koncentrowała się głównie na dużych wadach strukturalnych, ale subtelniejsze efekty, takie jak opóźnienie wzrostu i zmiany molekularne, mogą również mieć długotrwałe konsekwencje dla zdrowia. Carbamazepina dołącza teraz do listy związków, które mogą potencjalnie wpływać na wzrost embrionalny nawet przy niskich, środowiskowych stężeniach.

Dla lekarzy ważne jest, aby rozważyć te ustalenia w kontekście ogólnego ryzyka i korzyści związanych z leczeniem carbamazepiną podczas ciąży. Dla pacjentek z padaczką korzyści z kontroli napadów często przewyższają potencjalne ryzyko dla płodu. Jednak dla populacji ogólnej, w tym kobiet w ciąży, które mogą być nieświadomie narażone na carbamazepinę poprzez wodę pitną lub żywność, ustalenia te podkreślają potrzebę lepszych praktyk zarządzania wodą i ściekami oraz dalszych badań nad długoterminowymi skutkami zdrowotnymi przewlekłej, niskiej ekspozycji.

W miarę jak nasza wiedza o wpływie zanieczyszczeń farmaceutycznych na zdrowie rozwojowe ewoluuje, badania takie jak to dostarczają cennych informacji, które mogą pomóc w kształtowaniu polityki zdrowia publicznego i praktyki klinicznej. Choć potrzebne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć implikacje tych ustaleń dla zdrowia ludzkiego, ostrożne podejście wydaje się uzasadnione, szczególnie biorąc pod uwagę wrażliwość okresu rozwojowego i potencjalne długoterminowe konsekwencje nawet subtelnych zaburzeń wczesnego rozwoju embrionalnego.

To pionierskie badanie dostarcza pierwszych dowodów na to, że pasywne, przewlekłe narażenie na środowiskowe poziomy carbamazepiny może prowadzić do subtelnego, ale istotnego opóźnienia rozwoju embrionalnego. Wyniki te podkreślają znaczenie utrzymania wysokich standardów monitorowania jakości wody i oceny ryzyka dla zdrowia publicznego, szczególnie w kontekście ekspozycji kobiet w ciąży.

Podsumowanie

Badanie wykazało, że carbamazepina występująca w wodzie pitnej w stężeniach środowiskowych (200-2000 ng/L) może prowadzić do opóźnienia rozwoju embrionalnego u myszy. Zaobserwowano zależny od dawki spadek stadium embrionalnego, zmniejszoną liczbę somitów oraz opóźnienie w rozwoju serca. Analiza molekularna wykazała obniżoną ekspresję genów związanych z cyklem komórkowym (cyklina D1, CDK2) oraz genów rozwojowych (Oct4, Sox2, Sox9, Hand1). Mimo że nie zaobserwowano poważnych wad rozwojowych, wyniki wskazują na potencjalne ryzyko dla rozwoju płodu przy długotrwałej ekspozycji na nawet niskie stężenia carbamazepiny. Jest to szczególnie istotne w kontekście zanieczyszczenia wód i żywności tym lekiem przeciwpadaczkowym.